抗原檢測的原理是什么(抗原檢測技術(shù))
原標(biāo)題：2023年高考考點(diǎn)：抗原檢測原理（膠體金法）
國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制綜合組12月8日發(fā)布公告《新冠病毒抗原檢測應(yīng)用方案》，明確所有人員本著自愿原則，可以隨時進(jìn)行自身抗原檢測。那么您知道COVID-19抗原檢測的工作原理嗎？
膠體金檢測方法是一種定性檢測方法，涉及抗原和抗體的特異性反應(yīng)，即某種抗體與某種抗原的特異性識別和結(jié)合。然而，抗原和抗體的結(jié)合是肉眼看不到的，因此將抗體與膠體金偶聯(lián)。膠體金是金鹽還原成金元素后形成的金顆粒懸浮液。它通常呈紅色，在堿性條件下表面帶負(fù)電，因此可以與帶正電的物質(zhì)（如新冠病毒抗體）結(jié)合。COVID-19抗體的這兩種肉眼看不見的特性可以通過膠體金的顏色來顯示。
新型冠狀病毒抗原檢測試劑盒分為四個部分。第一部分是樣品孔，第二部分是膠體金納米粒子與新型冠狀病毒抗體的綴合物，第三部分是固定有新型冠狀病毒抗體的試紙條（標(biāo)記為T，即Test，檢測線），第三部分是固定有新型冠狀病毒抗體的試紙條。這四個部分固定的是另一種可以特異性結(jié)合新冠病毒抗體的抗體（標(biāo)記為C，即Control，質(zhì)控線）。
T線顯色的原理：
添加樣品后，樣品向前流動。當(dāng)?shù)竭_(dá)第二部分時，如果樣本中含有COVID-19抗原，膠體金偶聯(lián)的COVID-19抗體就會識別并結(jié)合COVID-19抗原，樣本繼續(xù)向前流動。當(dāng)?shù)竭_(dá)T線時，T一線新冠病毒抗體也會與新冠病毒抗原結(jié)合。即，形成“T系抗體-待測抗原-膠體金偶聯(lián)抗體”的三元復(fù)合物。大量膠體金固定于此，并顯示紅色條帶，判定為陽性。如果樣本中沒有COVID-19抗原，T線上的COVID-19抗體無法捕獲膠體金偶聯(lián)抗體。T線不顯色，判定為陰性。
C線顯色的原理：
樣品的向前流動帶動膠體金顆粒向前移動。多余的膠體金顆粒到達(dá)C線后，其偶聯(lián)的新冠病毒抗體與C線的抗體結(jié)合，大量積累并呈現(xiàn)紅色。如果C線上沒有紅色條帶，則說明抗原檢測板質(zhì)量有問題，檢測結(jié)果不可信。
“抗原檢測”檢測的是什么？
病毒就像包裹在軟糖餡料中的各種軟糖豆。
“軟糖三明治”位于病毒粒子的中心，其主要成分是核酸（ssRNA），為病毒的復(fù)制、遺傳和突變提供遺傳信息。外面的“軟糖”是病毒體的蛋白質(zhì)外殼，稱為“核衣殼”（N），它可以保護(hù)病毒核酸免受外界因素的損害，并介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。進(jìn)入之前，包裹在“糖衣”上的“糖衣”可以理解為病毒粒子的包膜。它是圍繞病毒核衣殼的雙層膜。
新型冠狀病毒的“糖衣”色彩極其豐富，其膜上有刺突糖蛋白（S）、包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）。這些結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白在不同的SARS-CoV-2病毒株中高度保守，具有良好的免疫原性。它是病毒感染細(xì)胞后表達(dá)量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，是很好的檢測生物標(biāo)志物。目前，新冠病毒抗原檢測一般以檢測N蛋白為主。
新冠病毒抗原檢測原理
假設(shè)這是含有新型冠狀病毒特異性抗原（N蛋白）的口咽/鼻咽拭子。拭子處理液釋放并洗脫后，N蛋白隨處理液一起滴入樣品孔中。
待測樣品在紙纖維形成的毛細(xì)力作用下從試紙的一端流向另一端。在這個過程中，N蛋白會經(jīng)歷三個層次。
注：第一級：金標(biāo)抗體（金標(biāo)2019-nCoV抗體）；第二級：T線抗體（2019-nCoV抗體）；第三級：C線抗體（“金標(biāo)2019-nCoV抗體”二抗）。
樣品在毛細(xì)作用下沿著測試卡的采樣孔端向前移動。如果樣本中含有新型冠狀病毒抗原，該抗原就會與膠體金標(biāo)記的COVID-19N蛋白抗體MAb1結(jié)合，形成新型冠狀病毒抗原-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物。復(fù)合物隨樣本繼續(xù)遷移至硝酸纖維素膜上，被固定在硝酸纖維素膜上的另一種新冠病毒N蛋白抗體MAb2抗體捕獲，形成紫紅色檢測線（T線），表明新冠病毒抗原是積極的；如果檢測線（T線）不顯色，則表明新冠病毒抗原呈陰性。檢測卡上還含有一條質(zhì)控線，即C線。無論樣品中是否含有相應(yīng)的分析物，都會出現(xiàn)紫紅色質(zhì)控線（C線），以判斷層析過程是否正常。
質(zhì)控：用于確定是否有足夠的樣品以及層析過程是否正常。當(dāng)金標(biāo)COVID-19抗體用液相色譜分離至質(zhì)控區(qū)（C）時，被羊抗小鼠COVID-19抗體捕獲，形成金標(biāo)COVID-19抗體抗COVID-19抗體復(fù)合物。材料，在質(zhì)量控制區(qū)域(C)中形成紅色帶。
【生物動畫】病毒抗原檢測原理（膠體金法）
新冠抗原居家自測步驟：
1.洗凈雙手，拿出檢測卡、采樣拭子、提取液等物品，檢查是否在有效期內(nèi)。
2.頭部微揚(yáng)，插入雙側(cè)鼻腔（1-1.5厘米），輕輕轉(zhuǎn)動（4次），并停留足夠的時間（15秒）
3.將取好的拭子浸泡在樣本提取液里面（20秒），擠壓拭子（5次），使得拭子上的樣本充分與提取液混合均勻。
4.折斷拭子頭，將加樣的蓋子蓋回提取液管。
5.取出新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測卡，檢查是否在有效期內(nèi)，并將其水平放置在臺面上
6.垂直加樣4滴到加樣孔中，計時15分鐘并等液體自然擴(kuò)散，在等待的時候避免移動檢測卡。
7.等待15分鐘后觀察結(jié)果
C區(qū)
T區(qū)
結(jié)果判定
紅條
紅條
正(+)
紅條
沒有任何
消極的（-）
沒有任何
紅條
無效的
沒有任何
沒有任何
無效的
8.檢測完畢，將所有東西收到垃圾袋里，妥善處理。
1膠體金
膠體金是膠體納米金，由氯金酸（HAuCl4）在還原劑（如白磷、抗壞血酸、檸檬酸鈉、單寧酸等）作用下聚合成一定尺寸的金顆粒，在靜電作用下變成金顆粒。穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電荷的疏水性膠溶液。
2023年高考考點(diǎn)
膠體金標(biāo)記主要包括三種力，即靜電相互作用、疏水相互作用和金硫鍵。膠體金在弱堿性環(huán)境中帶負(fù)電，可以與蛋白質(zhì)分子的帶正電基團(tuán)形成牢固的鍵合。由于這種結(jié)合是靜電的，因此不會影響蛋白質(zhì)的生物特性。
2個乳膠微球
乳膠法是以有色乳膠微球?yàn)檩d體的間接凝集試驗(yàn)?？扇苄钥乖皆谄浔砻妫禺愋钥贵w與其結(jié)合，引起凝集反應(yīng)。目前，免疫層析常用的彩色微球大多采用內(nèi)包埋法制備。染料位于微球內(nèi)部，不易滲漏，形態(tài)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。
免疫層析產(chǎn)品中使用的彩色乳膠微球粒徑比膠體金顆粒大（彩色乳膠微球粒徑為200nm-400nm，膠體金粒徑為20-40nm），相對靈敏度為更高。
乳膠微球顏色鮮艷，可包覆氨基、羧基、硫基等多種官能團(tuán)。因此，它們可以通過化學(xué)反應(yīng)或通過吸附（膠體金）以共價鍵的形式與抗體偶聯(lián)?？贵w只能通過吸附結(jié)合）。對于含有多個硫原子的分子，乳膠微球的標(biāo)記效果更好。
膠體金法和乳膠法的操作流程基本相似，以雙抗體夾心法為例：
雙抗體夾心法演示
3個熒光微球
熒光微球是指通過物理、化學(xué)方法標(biāo)記在顆粒表面或嵌入微球內(nèi)部的熒光物質(zhì)，如熒光素。它們一般呈球形，直徑從納米到微米不等，可以被激發(fā)光激發(fā)。發(fā)出肉眼可見的熒光。
熒光微球的形狀和尺寸比較穩(wěn)定，粒徑均勻，單分散性好，發(fā)光效率高，重復(fù)性好，與生物體相互作用后的各種反應(yīng)良好，吸附力強(qiáng)，比表面積大，表面積大。反應(yīng)能力強(qiáng)，凝集作用大。基本不受外界環(huán)境影響，熒光物質(zhì)光學(xué)穩(wěn)定性好，熒光強(qiáng)度需要通過免疫熒光分析儀讀取。熒光微球發(fā)出的熒光信號持續(xù)強(qiáng)且穩(wěn)定，易于用儀器檢測熒光信號。
熒光免疫層析是利用熒光微球表面修飾的官能團(tuán)（如羧基）與抗原或抗體共價結(jié)合，利用熒光物質(zhì)發(fā)出穩(wěn)定、強(qiáng)的熒光信號進(jìn)行定量檢測。
總的來說，這三種免疫層析標(biāo)記物各有優(yōu)點(diǎn)。膠體金法和乳膠法的特點(diǎn)是不需要使用特殊儀器，通過肉眼即可判斷。操作簡單，檢測時間短。其中乳膠法顯色能力更強(qiáng)，結(jié)果顯示更直觀。與膠體金法、乳膠法相比，熒光免疫層析法靈敏度更高，但使用時需要配套的熒光檢測器。目前尚無家用型，且儀器價格較高。此外，熒光微球的成本高于膠體金和乳膠，且其可及性存在偏差。
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